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                    激光共聚焦顯微鏡在藥劑學中的應用

                    發布時間:2023-03-31      點擊次數:542

                    激光共聚焦顯微鏡(K1-Fluo)是一種對樣品無損害的新型成像設備,在醫學,生物學,藥學等方面得到了廣泛的應用。激光共聚焦顯微鏡采用的是針孔成像的原理:在物鏡的焦平面位置設置一個帶有針孔的擋板,從而消除焦點以外的雜散光,從而消除了球差,并進一步消除了色差,并且通過專屬的PZT 可以實現納米精度的軸向移動,從而獲得更高精度的二維光學且切片,得到分辨率更高的三維圖像。


                    CLSM的主要優點是:高清晰度,定位準確,不會損傷樣品等。由于激光共聚焦顯微鏡采用的是無損檢測的方式,因此在進行活細胞研究時,不需要對樣品進行預處理,能很好地在線樣品的真實圖像。目前,激光共聚焦顯微鏡主要應用在藥劑學領域的藥物經皮和粘膜吸收的研究,粘膜吸收促進劑作用機制的研究,藥物的細胞攝取,穿透性能及于細胞相互作用的機制研究和載藥微粒結構觀察,藥物成型機制及釋藥機制等方面的研究。

                     

                    1.1  在藥物劑型經皮和粘膜吸收方面的應用

                    激光共聚焦顯微鏡應用于脂質體經皮吸收研究

                    影響藥物皮膚吸收的因素很多,包括分子大小,組分的親酯性,處方組成,滲透促進劑的使用及皮膚角質層的物理狀態等。Verma等研究了兩種熒光標記脂質體的大小對皮膚吸收的影響,實驗中將親水性熒光復合物羧基熒光素(CF)和親脂性熒光復合物1.1-雙十八烷基-3.33.3-四甲基靛炭-喹啉藍高氯酸鹽(DiI)包裹入脂質體,應用Franz擴散池和標準皮膚洗提技術進行人體腹部皮膚的體外滲透試驗,以找到脂質體局部用藥的最佳粒徑。通過CLSM觀察脂質體滲透能力,發現Dil脂質囊泡粒徑為71nm時在皮膚中熒光強度最大,CF脂質體粒徑為120nm時能更好地促進皮膚的滲透。Verma等在研究以脂質體為載藥系統將藥物運載至皮膚的機制中,將脂質體用CF標記后,用CLSM技術可得到CF經過預定的時間到達表皮及皮膚深層的量。López-Pinto等也通過CLSM研究以米諾地爾為模型藥物制備的短鏈醇類的磷脂脂質體及普通脂質體的透皮效果,結果發現短鏈醇類的磷脂脂質體的透皮數量及深度均高于普通脂質體。CLSM不用對樣品進行凍結固定就能直接觀察,且能穿透皮膚深層進行觀察,所以被廣泛地應用于親水和親脂標記物在皮膚中的顯像及標記物強度的分析中。

                     

                    1.2 CLSM 在微粒粘膜吸收方面的應用

                    近年米,膠體載藥系統由于能延長藥物在血液中的循壞時間而備受關注。其中將藥物可降解的納米粒用聚乙二醇(PEG)包衣是一很有前景的載藥系統。與未包衣的聚乳酸(PLA)微粒相比,PEG長循環微粒被單核巨噬細胞攝取的量有所降低。PEG長循環納米粒不僅能延長藥物循環時間,Tobio等發現它還能影響PLA納米粒與生物膜表面諸如鼻粘膜及腸粘膜的相互作用,是粘膜藥的良好載體系統。為研究PLA-PEG納米粒粒徑及PEG包衣密度對鼻粘膜轉運的影響,Vila等用不同分子量的PLA-PEG聚合物及不同的制備方法制備了不同粒徑、不同PEG包衣密度的PLA-PEG納米粒,將這些熒光標記的微粒鼻腔給藥后,通過CLSM技術研究它們與小鼠鼻粘膜的相互作用及其轉運過程。CLSM結果顯示PLA-PEG納米粒在鼻粘膜中的熒光強度遠高干PLA納米粒,表明PEG包衣對促進鼻上皮細胞轉運有較大影響。同時小鼠鼻粘膜共聚焦圖像結果表明PLA-PEG粒子能穿透粘膜,其穿透能力不僅受粒子粒徑影響,也與PEG包衣密度有關。

                    CLSM在考察某種聚合物能否作為粘膜吸收的載體材料時也發揮了重要作用。Vila等通過CLSM考察了低分子量殼聚糖(CS)納米粒能否作為一種長效鼻用疫苗的載體。他們將破傷風毒素(TT)用離子交聯法包裹入低分子量CS納米粒中,異硫氰酸熒光素牛血清白蛋白(FITC-BSA)標記后應用CLSM觀察納米粒與小鼠鼻粘膜的相互作用。結果表明CS納米粒能穿透鼻上皮細胞,從而可以運載抗原,說明低分子量CS是一較有前景的鼻用疫苗運輸載體。

                     

                    1.3 CLSM 應用于口服疫苗腸粘膜吸收的研究

                    口服疫苗在很多方面優于注射劑,但疫苗在消化道易降解且較難進入胃腸道的淋巴組織,限制了口服疫苗的發展。Lubben等用CLSM技術研究了殼聚糖微粒被鼠類腸道Pever's片段攝取的情況,CLSM結果顯示抗原卵白蛋白被包裹于殼聚糖微粒中,結合體內試驗證明了熒光標記的殼聚糖微粒能被小鼠Pever's片段的上皮組織吸收。同時進行的其它實驗表明所制備的殼聚糖微粒的釋放行為適合用于口服,而Pever's片段的吸收是口服疫苗的關鍵過程,這些結果表明殼聚糖微粒是一很有前景的疫苗轉運載體。

                     

                    2. CLSM 應用于粘膜吸收促進劑作用機制的研究

                    對于甲基B一環糊精促進鼻粘膜吸收的作用機制,有人認為是通過打開鼻上皮組織緊密連接達到細胞增滲作用的。Marttin 等用透射電子顯微鏡研究了甲基B一環糊精對鼠鼻上皮組織緊密連接的影響,用CLSM研究了甲基B一環糊精對鼠上皮組織細胞骨架的影響,并將甲基B一環糊精的作用與吸收促進劑?;嵌溏匏崦顾剽c(STDHF)做比較。發現小鼠鼻腔給予2%田基B一環糊精后細胞骨架肌動蛋白的分布與未處理的對照組相同,說明甲基B一環糊精并不是通過對細胞骨架的作用以打開細胞的緊密連接。而注射1%STDHF的小鼠肌動蛋白分布發生了改變,鼻上皮組織也被嚴重破壞,通過CLSM發現STDHF會使細胞腫脹及粘液外滲,說明STDHF并不是暫時打開緊密連接,它損壞了上皮組織破壞了細胞緊密連接的完整性。因此Marttin等推斷甲基B一環糊精的促吸收機理是通過提高膜流動性以打開細胞緊密連接的??梢娡ㄟ^CLSM的直觀觀察有助于研究物質的吸收機制,從而應用到基礎理論的研究中。

                     

                    3.CLSM 應用于載藥微粒的結構研究

                    觀察微球和微囊的常用方法有光學顯微鏡(LM)和掃描電子顯微鏡(SEM),但LM易受光學焦平面以外的散色光的影響而降低成像質量,對透光率差或不透光的材料制成的微球,只可觀察其形態和外部結構:SEM通常需要對樣品進行預處理且不能用干觀察物體的內部結構,所以需要尋找一種能用于觀察微粒內部結構的顯微技術。Lamprecht等在1999年探討了CLSM是否能作為觀察微囊結構特征的新工具。他們應用復凝聚法制備微球,然后將油相、明膠、阿拉伯膠分別進行熒光標記。通過CLSM首先成功定位了尼羅紅標記的油相;其次,通過CLSM考察了異硫氰酸熒光素(FITC)標記的明膠及羅丹明B異硫氰酸(RBITC)標記的阿拉伯膠兩種聚合物在囊壁材料中的分布。研究結果表明CLSM可用干評價和描述微球,觀察被包封相的分布,沉積和微球表面及內部聚合物的結構,它能提供微粒的三維視圖且具有很高的清晰度。

                    近年來,國內也開始應用CLSM技術分析載藥微球的結構。譚豐蘋、陸彬等以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白藥物,以聚合物明膠與阿拉伯膠為成球材料制備了微球,應用CLSM將微球在不同熒光通道下成像,并將微球切割成一系列平行切面并分別成像.對微球進行三維重建和圖像分析。魏農農等利用雙重標記法分別對殼聚糖和磷脂進行標記,用前體脂質體方法制備氟尿嘧啶脂質體,利用CLSM觀察殼聚糖包衣脂質體的形態,為進一步研究該給藥系統提供依據。CLSM作為一種非破壞性觀察微粒的方法,可使焦平面以外的散射光減到lowest, 提高呈像質量,并可通過使用不同的熒光標記物識別幾種不同的化合物。若材料或藥物可被熒光標記,CLSM就可觀察微粒表面及內部的結構:通過斷層掃描收集數個平行切面的數據,使觀察樣品的三維圖像并分析成為可能。因此,采用CLSM對微粒結構進行研究將具有很好的應用前景。如Mladenovska等在研究5-氨基水楊酸殼聚糖_-藻酸鹽微球的理化性質中應用CLSM分別觀察了殼聚糖及藻酸鹽在微球中的分布,結果顯示殼聚糖均勻分布于微球外部的囊殼中,而藻酸鹽則分布于微球的內部,且由于異電性相吸在殼聚糖的邊緣分布較為集中,這證實了殼聚糖成功地包覆了5-氨基水楊酸微球,且聚合材料的理化性質在制備微球的過程中并未發生變化,保持了原有的荷電性及表面活性。與普通的光學顯微鏡及電子顯微鏡相比,CLSM能提供微粒的更多信息,如微粒的三維結構和囊壁聚合物的組成等,甚至能夠在不破壞微球的條件下測得其包封率,但對于形狀不規則及非球形的微粒還不適用。

                     

                    4.CLSM 應用于藥物成型機制和釋藥機制的研究

                    片劑是一傳統的、應用廣泛的劑型,而片劑的成型機理卻是較復雜的。為了研究核黃素磷酸鈉片的成型機制,Guo 等借助 CLSM 觀察核黃素磷酸鈉與兩種不同型號的微晶纖維素(MCC)PH-101 PH-102 的混合物在不同壓力下的顯微結構,結果發現在所壓制的片劑中藥物形成了結晶,進而推斷出藥物成型機制為:在壓力作用下核黃素磷酸鈉所含水分溶解了藥物形成一層液膜,藥物發生重結晶,同時在壓力作用下,由內部摩擦產生的熱引起藥物的熔化,當熱量慢慢下降時,藥物呈燒結狀。通過此研究也發現 MCC 是壓縮性較好的一種填充劑,在防止藥物在壓力下破碎起到了重要的作用。

                    早在 1995 Cutts 等發展了一種基于CLSM技術的新方法,可用于定量地監控控釋制劑的藥物釋放過程,描述藥物從固體制劑中的釋放過程,找出合適的釋藥模型。Guo 等用 CLSM 研究支鏈淀粉水性包底衣對腸溶衣小丸抵制胃酸作用的釋藥機制。他們用 CLSM 研究了腸溶包衣小丸的釋藥過程,發現淀粉包底衣腸溶小丸比 HPMC 包底衣小丸在 0.1mol/L HCI溶液中的抗酸能力強。CLSM所得圖像及核黃素磷酸鈉鹽(RSP)的熒光分布圖與溶出結果一致:以淀粉包底衣能延緩溶出介質向小丸丸芯滲透,從而減少了腸溶小丸在 0.1 mol/L HCI溶液中的釋藥。經研究其釋藥機制是釋放介質靠滲透壓進入丸心溶解藥物,然后藥物再從包衣膜中擴散出來。除此之外,Guo .進一步用 CLSM 研究兩種含有不

                    同輔料的包衣丸藥物在包衣層的擴散。通過 CLSM 在不同厚度包衣層中藥物熒光強度的定量測定,較好地展示了以支鏈淀粉為輔料的包衣丸無藥物遷移,而以乳糖為輔料的包衣丸有較多的藥物遷移,因而影響藥物的釋藥性能。CLSM 結合數學模型用于研究藥物釋藥過程是其在藥學領域中的又一新應用,使用 CLSM不會損壞樣品,可以清楚地觀察藥丸在水化作用下發生的變化,結合數學模型得到藥物制劑相應的釋放方程及釋藥機制。目前關于 CLSM 在這一方面應用的報道還較少。

                     

                    展望

                    在只要領域,熒光顯微鏡已經廣泛應用于研究候選藥物于細胞的相互作用,而對于細胞成像,共聚焦顯微鏡在空間分辨率和數據質量上已經有了顯著的提高。

                    CLSM除了用于熒光物質的成像外,還可以用反射光模式觀察費熒光物質的成像,例如,可用熒光激發模式和反射模式同時觀察熒光藥物在某個特定細胞或組織中的穿透情況和相互作用。

                    CLSM 還可與其它科學技術聯合應用,開辟新的研究領域。如和光譜結合可分析標記物的熒光亮度,熒光壽命,光譜特點,通過對這些參數的研究可以了解目標化合物和靶向生物分子的結合,從而可用于復雜的生化藥物篩選的定量分析。從這些眾多的熒光特性中,可以選擇最佳的參數作為篩選藥物定量分析的基礎,或者借助多參數分析鑒別化合物的研究技術成果和所起到的真正的藥理作用。

                    另外,CLSM 和多光子技術結合為動態觀察和實時分析研究提供了可能。CLSM 存在激發波長有限和時間分辨率不高的缺陷。然而,隨著CLSM 技術的進一步發展成熟和人們對CLSM技術認識的加強,它在藥學研究領域必將得到更加廣泛和深入的應用。


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